조국 딸 조민의 논문 번역, 해석

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조민이 제1저자로 참여한 논문의 제목은 출산 전후 허혈성 저산소뇌병증(HIE)에서 혈관내피 산화질소 합성효소 유전자의 다형성이고 아래 내용은 해석과 번역이다.

주산기 저산소성 허혈성 뇌병증에서 eNOS 유전자 다형성

Min Cho(조국 교수 딸 당시 한영외고 2학년) - 제1저자는 맨처음 나온다.

Kwang-Sun Hyun(당시 단국대학교 박사후 과정 연구원)

David Chanwook Chung(단국대병원 소아과)

In-Young Choi(단국대학교 병원 임상강사 현재, 가톨릭대 의대 교수)

Myeung Ju Kim(김명주 단국대 교수)

Young Pyo Chang(장영표 단국대 교수)

서론

산화질소는 산화질소 합성효소에 의해서 L-아르기닌에서 L-시트룰린으로 산화될 때 만들어진다.내피 세포들은 내피 산화질소 합성효소(eNOS)를 통해 산화질소를 생성할 수 있다.이 산화질소들은 혈관의 탄력성을 유지하는데 중요한 생리적 역할을 한다.

또, 산화질소는 평활근의 생장을 조절하고 백혈구가 내피에 달라붙는 것을 늦춰주며혈소판의 응집을 억제한다. 산화질소는 사람의 심혈관계 질환의 병태생리(어떤 질병이나 질환이 처음 발병할 때의 원인과 그 진행과정을 말한다.)에중요한 역할을 한다.

산화질소의 생산 및 활동 저하는 고혈합, 혈전증, 혈관연축, 동맥경화를 일으킬 수 있다.혈관에서 산화질소의 생산은 eNOS 유전자에 의해 조절되는 eNOS 발현정도에 연관성이 있는 것으로 생각된다.그러므로 eNOS의 다형성(같은 종의 생물이지만, 모습이나 고유한 특징이 다양한 성질)의 변동성을 조사하는 것이허혈성 심질환 및 뇌혈관 질환과 같은 많은 혈관성 질환에서의 유전적 연관성을 설명할 수 있게 해줄 수 있다.

eNOS 유전자의 다형성은 뇌졸중 환자군 집단 중 고령과 인종별로 이미 조사된 적이 있다.비록 연구들 사이의 결과가 상이하긴 하지만, eNOS 다형성이 뇌졸중과 연관이 있다는 것은 일맥상통한다.eNOS 유전자는 7q35-36 염색체에 자리해있으며, 26 엑슨(엑슨:진핵생물의 유전자 가운데 최종 단백질 산물을 만들어 내는 부분, 혹은 전사 이후에 일어나는 RNA 가공 후에도RNA의 구조적 부분으로 남아 있는 부분)으로 구성돼 있다.

eNOS 유전자의 여러 다형성중, 뇌혈관질환과 연관있는것으로 조사된건 다음 3가지이다.

the Glu298Asp polymorphism in exon 7, the variable number of tandem repeats[VNTR, 27 bp repeat] polymorphism in intron 4, and the T-786C polymorphism in the 5′-flanking region of eNOS

출산전후 저산소성 허혈성 뇌병증(Perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)은 출산시 신생아에게자주 일어날 수 있는데, 심하고 오래갈 경우 신경학적 손상을 유발할 수 있다.
출산전후 HIE에서의 뇌혈류량 감소는 산화질소의 활동성과 연관이 있음이 밝혀졌다.혈관내피에서 생성되는 산화질소는 뇌혈관의 확장을 유도한다. 이것으로 뇌혈류량을 늘리게 된다.

하지만 허혈상태인 동안 산화질소로 인한 혈관 확장으로 뇌혈류량이 증가하면, 재관류 손상을 유발할 수 있다.(수술후 마취를 하게 되면 혈액의 흐름이 일시적으로 정지되는데마취에서 깨어났을 때 혈액이 다시 흐르면서 엄청난 활성산소가 생기고 이로 인해 여러 조직들이 손상받기 쉬운 상태.)(역주: 뇌경색등으로 혈관이 막혀 피가 적게가다가 혈관 개통되어 다시 많이 가는 경우 재관류 손상이 올수 있습니다.)
게다가 저산소성 허혈의 경우 과도하게 만들어진 산화질소가 슈퍼옥사이드와 반응이 일어나서 지질의 과산화반응과신경 손상을 일으킬 수 있는 활성 퍼옥시나이트라이트를 생성할 수 있다.

출산전후 HIE 환자들에게는 eNOS 다형성의 변동성이 신생아 시기 뇌에서의 eNOS 활동성 및 산화질소 생성과 연관있으며이로 인해 임상적으로 나타나는 결과가 달라질 수 있다.그러나 이전에는 eNOS과 출산전후 HIE에 관한 리포트가 없었다.

그래서 이 연구는 PCR(중합효소 연쇄 반응. DNA를 증폭하는 검사방법)을 사용하여 출산전후 HIE 환자에게 임상적으로연관이 있는 eNOS 유전자의 다형성에 대해 평가했다.
추가컨대 eNOS의 다형성과 출산전후 HIE의 합병증이 연관돼 있는지에 대해서도 같이 접근하였다.

재료 및 방법(실험 방법)

실험대상(연구군)이 연구의 연구집단은 정상 혹은 만삭아(역주:예상된 출산시기가 거의 다 되어 태어난 아이를 뜻함. 얼마전에'후기 미숙아'로 바꾸자고 했던 말이 있던 듯합니다.) 중 중증도-중증 출산전후 HIE를 겪은 37명의 환자집단(HIE군)과 54명의 출산전후에 문제가 없는 정상 출생아(대조군)로 구성했으며, 이들은 2002년과 2004년 사이단국대병원 신생아 중환자실 혹은 신생아실에 입원하였다.

출산전후 HIE 집단은 모두 출산전후 질식(가사, asphyxia)의 진단기준을 만족하였으며 출산전후 질식의 급성 뇌병증 양상을 보였다.모든 HIE 집단은 Sarnat 분류(출산전후 HIE에 대한 분류 척도.)로 따졌을 때 중증도에서 중증의 임상적 경과를 보였다.

HIE 집단의 제태연령(임신0일부터 출산 후까지의 기간)은 36주 이상이었고, 5분 아프가 점수(역주:신생아의 상태평가를하는 척도입니다.)는 7점 미만, 혈액가는 산성(pH<7.2), 저산소 및 과탄산증이었다.

신생아중 중대 선청성 질환, 자궁내 감염, 패혈증, 다태분만(다산), 과숙아는 배제됐다.모든 신생아는 한국계였고 혈연관계는 없었다.모든 신생아의 부모님들에게 인폼드 컨센트를 받았다.(역주:연구 동의 받았다는 얘기입니다.)연구는 단국대 연구회로부터 승인되었다.

DNA 추출과 제노타이핑(제노타이핑:개체가 가지는 유전형의 다양성을 분석하는 일)말초혈액이 추출됐으며, EDTA 튜브에 담겼다. 게놈의 DNA는 혈액의 백혈구에서 추출되었다.

3개의 임상적으로 연관있는 eNOS 다형성은 이전에 연구되었던 대로 결정되었다.엑슨 7의 Glu298Asp 제노타이핑은 전사 및 역전사 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭으로 하였다.(각각 5′-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3′and 5′-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3′)

증폭된 258-bp 절편은 Banll라는 제한효소를 분해하였으며, 63 bp와 85 bp 절편으로 분해된 군과(wild-type allele ‘‘G’’), 분해되지 않은군으로 나뉘었다. (variant allele ‘‘A’’)

이 절편들은 12% 아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분석되었고, 실버 스테인으로 시각화됐다.5′-flanking region(유전자의 5'말단에 인접한 DNA 영역) of eNOS에서의 T-786C 다형성을 검출하기 위해,각각 PCR을 사용하였다.

증폭된 결과물들은 Mspl에 의해 분해되었으며, 140bp 40bp로 분해되는 wildtype allele과,90, 50, and 40으로 분해되는 variant (allele ‘‘C’’)로 나뉘었다.

이 절편들은 12% 아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분석되었고, 실버스테인으로 시각화되었다.인트론 4의 VNTR 다형성을 관찰하기 위해 각각 5′-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3′와5′-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3′ 전사 및 역전사 프라이머를 사용하였다
이 PCR 생성물들은 2.5% 아가로오스 겔 전기영동으로 분석되었고, 브로민화 에티듐(DNA에 결합하는 색소로서 전기영동을 통해 DNA의 크기를 측정하고자 할 때 염색물질로 쓰였으나, 발암성 물질로 알려져 있다.)스테인으로 시각화되었다.

420 bp의 야생형은 5개의 27 bp repeat들로 되어있었고 (the ‘‘b’’ allele),393개 bp 변종들은 4개의 27 bp repeat들로 되어있었다 (the ‘‘a’’ allele)

eNOS 유전자 세개의 다형성의 유전자형은 피규어 1번에 있다.VNTR의 4aa와 T-786C의 CC는 이 연구에서는 어느 신생아에서도 검출되지 않았다.

Statistical analysis (통계 분석)

이 데이터는 윈도우 14.0 버전의 SPSS 통계 패키지 프로그램으로 분석되었다.유전자형의 관찰된 빈도는 Hardy-Weinberg 평형에서 기대되는 빈도 수치와 비교되었다.유전형질, 대립유전자, 하플로타입의 빈도의 차이는Student’s t-test, or Fisher’s exact test로 검정되었다.p밸류는 0.05 미만이 의미있는 것으로 생각하였다.승산비(두 집단의 이항변수에 관한 승산(odds)의 비를 가리킨다.)와 95퍼센트 신뢰구간은 제시된 바대로 따랐다.

결과

이 연구에 포함된 영아의 임상 특성은 표 1에 나와 있다. 출생 평균 체중과 임신 연령은 HIE와 대조군 사이에 유의한 차이가 없었다. 1 및 5 분의 Apgar 점수는 대조군보다 HIE 군에서 유의하게 더 낮았다(p 다른 병원이나 외부 병원에서 태어난 HIE 영아의 수는 21 명 (56.8 %)이지만 대조군에는 없었다. 제왕 절개는 HIE 군에서 22 명 (59.5 %), 대조군에서 15 명 (27.8 %)에서 유의미하게 나타났다 (p 출생 질식과 관련된 Meconium staining 및 태아 절박가사는 HIE 그룹에서만 관찰되었다.

그림 1. eNOS의 인트론 4의 5'- 플 랭킹 영역에서의 T-298C 다형성 및 VNTR 다형성에 대한 엑손 7의 Glu298Asp 다형성에 대한 유전자형 분석이다. PCR 산물은 특정 유전자형을 유발하는 상이한 단편을 생성하는 제한 효소로 분해되었다. VNTR의 유전자형 4aa 및 T-786C의 CC는 연구된 영아에서 검출되지 않았다.

값에 조사된 대립 유전자 수 (pcorr)를 곱하여 세 가지 특정 경우의 유전자형 및 대립 유전자 빈도를 살펴보았다. eNOS 유전자의 승산비(OR) 및 조사된 다형성은 표 2에 제시되어있다. 각 군에서 다형성의 유전자형 빈도는 하디 와인버그 평형과 일치 하였다. 3 가지 다형성과 관련한 유전자형의 분포는 대조군과 HIE 그룹간에 유의 한 차이가 없었다. 대립 유전자 빈도의 분석에서, Glu298Asp의 G 대립 유전자는 대조군보다 HIE 군에서 더 빈번 하였다 (pcorr=0.036). HIE 그룹에 대한 G 대립 유전자의 OR은 8.28(95 % CI, 1.05-65.57)이었다. 대조군과 비교한 HIE 합병증 하위군은 T-786C의 TC 유전자형 및 C 대립 유전자가 대조군보다 (P = 0.001 및 pcorr = 0.002) 유의미하였다. PPHN에 대한, TC 유전자형 및 C 대립 유전자의 OR은 각각 24.00 (95 % CI, 2.14-269.11) 및 10.20 (95 % CI, 1.96-53.18)이었다. eNOS 다형성의 8 가지 haplotype형 중에서, 빈도가 5 % 초과인 5 개가 표 3에 제시되어있다. haplotype형 빈도의 비교는 대조군과 HIE 그룹 사이에서만 수행되었다. A b T haplotype형의 빈도는 대조군보다 HIE 군에서 유의하게 더 낮았다 (p = 0.029). HIE에 대한 A b T haplotype형의 OR은 0.12 (95 % CI, 0.02-0.96)였다.

표 1. 이 연구에 포함된 영아의 임상 특성

* p HIE로부터 비교로 얻어짐.

HIE, 저산소성 허혈성 뇌병증; CS, 제왕 절개; BOH는 다른 병원이나 외부 병원에서 태어난 경우.

표 2. 주산기 HIE 및 대조군에서의 eNOS 유전자의 유전자형 분포 및 대립 유전자 빈도

* p = 0.001, OR = 24.00 (95 % CI; 2.14, 269.11); pcorr = 0.036, OR = 8.28 (95 % CI; 1.05, 65.57); pcorr = 0.002, OR = 10.20 (95 % CI; 1.96, 53.18)이며, 이는 대조군과 비교하여 얻어진다. n, 주제 수; HIE, 저산소 성 허혈성 뇌병증; 또는 승산 비; CI, 신뢰 구간; MAS, 메 코늄 흡인 증후군; RDS, 호흡 곤란 증후군; PPHN, 지속적인 폐 고혈압 증후군; SZ, 발작.

표 3. 주산기 HIE 및 대조군에서의 eNOS 유전자의 haplotype형 빈도.

HIE, 저산소성 허혈성 뇌병증; 또는 승산 비; CI, 신뢰 구간.

토론

NO는 HIE, 기관 지폐 이형성증, 심실내 출혈, 조기 망막 병증 (ROP) 및 괴사성 장염과 같은 주산기 사건과 관련된 여러 신생아 질환의 발병에 중요한 역할을 한다.

NO는 뇌 혈류를 조절함으로써 뇌졸중 후 뇌 허혈의 정도를 조절하는 것으로 나타났다. 그러나, 주산기 및 신생아 질환의 임상 증상과 eNOS의 상관 관계는 밝혀져야한다. 최근에, eNOS 27-bp 반복 다형성은 심각한 ROP 위험과 기능적 연관성을 갖는 것으로 제안되었다. 따라서, eNOS 유전자의 분석은 HIE와 관련된 중요한 유전 적 다형성과 그 합병증의 상관 관계에 대한 통찰력을 제공할 수있다. eNOS 유전자에 대한 여러 연구에서 뇌혈관 질환 및 관련 임상 증상, 질병 경과 및 합병증과 강한 상관 관계가 있음이 밝혀졌다. 그러나, 이전의 연구는 엑손 7에서 Glu298Asp 다형성과 허혈성 뇌혈관 질환 사이의 상관 관계가 거의 없음을 보여 주었다. 또한, 다른 연구팀은 인트론 4에서 27 bp 반복 VNTR 다형성이 일본 연구에서 뇌 혈관 질환의 위험 인자가 아니라고 주장했다. 그럼에도 불구하고 exon 7에서 Glu298Asp 다형성의 G 대립 유전자에 대 한 뇌 경색, 특히 lacunar 경색, homozygosity의 연관성이 제안되었다. 백혈구 제거증이 없는 유두 경색에 대한 연구는 또한, 인트론 4에 위치한 VNTR 다형성과의 관련성을 보여 주었다. 또한, eNOS 5'- 플 랭킹 영역에서 T-786C 다형성은 허혈성 뇌졸중의 위험 인자로 간주되었다. 이전의 발견과 일치하여, 본 연구는 엑손 7에서 Glu298Asp의 G 대립 유전자와 주산기 사이의 가능한 연관성을 보여 이 연구에서 표본 크기가 작지만이 결과의 해석이 제한적이다. 주산기 HIE를 포함한 뇌혈관 질환에서 G 대립 유전자의 빈도는 HIE의 발병 기전에서 NO의 역할에 의해 설명될 수있다. 따라서, 노인 집단의 뇌경색과 마찬가지로, G 대립 유전자는 주산기 HIE의 위험인자일 수 있으며, 주 산기 HIE의 임상 적 심각성은 eNOS 유전자 변이와 관련이있는 것으로 보인다. HIE의 합병증으로 PPHN을 가진 4 명의 영아가 이 연구에서 조사되었다. 출생시 eNOS 활동은 혈관 확장 폐 적응을 유지하는 데 중추적인 역할을 할 수 있다. 그러나, eNOS의 억제 또는 발현 감소는 PPHN- 유사 질환을 초래할 수있다. 따라서, 출생시 폐 혈관 확장 적응의 실패는 일반적인 주산기에 일어나는 일로서 폐 동맥 수축을 자극한다. 동맥관 and/or 에서 구멍 난소를 통해 오른쪽에서 왼쪽으로 션트하는 폐 혈관 수축으로 인한 폐 고혈압은 PPHN의 주요 병리학적 소견이다. 따라서, PPHN에 대한 임상 치료로서, 폐 흡입을 선택적으로 확장시키기 위해 NO 흡입이 일반적으로 사용된다. eNOS 유전자 변이에 대한 이전의 연구는 PPHN에서 eNOS 유전자의 발현이 감소되었음을 보여주었다. 또한 PPHN을 가진 영아의 내피 세포에서는 eNOS의 mRNA가 검출되지 않았다. 우리의 연구에서, T-786C의 TC 유전자형 및 C 대립 유전자는 HIE의 합병증으로 발생하는 PPHN의 위험인자 인 것으로 나타났다. 그러나, 본 연구에서는 T-786C의 TC 유전자형과 C 대립 유전자가 NO 생성 감소와 기능적 상관 관계를 가진다는 한계가 있다. 왜냐하면 우리는 플라즈마 아질산염 및 질산염 (NOx) 수준 and/or 변화를 평가하려고 시도하지 않았기 때문이다. 효소의 활동 및 몇몇 연구는 eNOS 유전자의 유전 적 다형성과 NOx 수준의 상관 관계를 보여 주었다. 최근에, 필수 고혈압과 관련된 eNOS 변이체 및 4-locus haplotype에 대한 연구는 통계적으로 유의한 대조군보다 환자에서 NOx의 감소를 입증했다 (p 이것은 eNOS 유전자의 엑손 7에서 Glu298Asp의 G 대립 유전자와 주 산기 HIE 사이의 관계를 보여주는 첫 번째 연구이다. 또한, T-786C의 TC 유전자형 및 C 대립 유전자는 HIE의 합병증 인 PPHN과 관련이있는 것으로 관찰되었다. eNOS 다형성의 유전적 중요성을 확인하고 신생아 질환에 대한 eNOS의 유전적 영향을 평가하려면 PPHN을 가진 많은 HIE 환자를 대상으로 한 추가 조사가 필요하다.